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蛋白互作
時間:2021-04-20

蛋白質間的相互作用構成了細胞生化反應網絡的一個主要組成部分,蛋白-蛋白互作網絡與轉錄調控網絡對調控細胞及其信號有重要意義。本文總結了七種蛋白質相互作用的方法。

01免疫共沉淀技術
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是:細胞裂解液中加入抗體,與抗原形成特異免疫復合物,經過洗脫,收集免疫復合物,然后進行SDS-PAGE及Western blotting分析。

但這種方法有兩個缺陷:一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;二是必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

02pull-down技術

蛋白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見,最好通過免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系,從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。

03酵母雙雜交系統

酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后,誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子,啟動報道基因在酵母細胞內的表達,如果檢測到報道基因的表達產物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化后則可用于大規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中,人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。此外,酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。

04噬菌體展示技術

在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列,當噬菌體生長時,表面就表達出相應的單抗,再將噬菌體過柱,柱上若含目的蛋白,就會與相應抗體特異性結合,這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用,不僅有高通量及簡便的特點,還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前,用優化的噬菌體展示技術,已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文庫,并分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。

05等離子共振技術

表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”,當待測蛋白與誘餌蛋白結合后,薄膜的共振性質會發生改變,通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料,反應過程可實時監控。測定快速且安全,還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。

06熒光能量轉移技術

熒光共振能量轉移(FRET )廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用;與熒光顯微鏡結合,可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白(GFP)的發展,FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法,僅需使用一組濾光片和測量一個比值,利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速,可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離,尤其適用于基于GFP 的供體受體對。

07抗體與蛋白質陣列技術
蛋白芯片技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變,微型化,集成化,高通量化的抗體芯片就是一個非常好的研究工具,它也是芯片中發展最快的芯片,而且在技術上已經日益成熟。這些抗體芯片有的已經在向臨床應用上發展,比如腫瘤標志物抗體芯片等,還有很多已經應用到各個領域里。
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